استخراج اسید نوکلئیک از مخمر
مقدمه:
نخستین گام در بررسی مولکولی ساختار ژنتیک سلول ها دسترسی به مادة ژنتیک می باشد. اصول استخراج مادة ژنتیک از سلول های مختلف (باکتری ها، سلول های گیاهی و سلول های جانوری) نسبتا یکسان است و تنها در برخی از جزئیات تفاوت هائی وجود دارد. استخراج اسید های نوکلئیک شامل دو مرحله تهیه عصارة سلولی و خالص سازی می باشد.
تهیه عصاره سلولی برای تهیه عصارة سلولی به تعداد زیادی سلول نیاز است. عموما سلول ها با تکثیر در محیط کشت ویا مستقیما از بافت ها (مانند بافت خون ) تأمین می شوند. سپس باید دیواره و غشاء سلول ها از بین بروند تا محتویات آنها آزاد شوند. برای تخریب دیواره یا غشاء سلولی، روش های فیزیکی و شیمیایی مختلفی بکار میرود. از روش های فیزیکی می توان به شوک اسمزی، سائیدن سلول های یخ زده و استفاده از امواج صوتی یا سونیکیشن اشاره کرد. در سونیکیشن، طول موج و شدت امواج صوتی به کار گرفته شده به نوع سلول و کاربردی که از عصارة سلول مورد نظر است، بستگی دارد. در روش های شیمیایی از آنزیم ها و موادی که باعث تخریب دیواره و غشاء می شوند استفاده می شود. برای مثال، برای شکستن دیوارة باکتری ها از آنزیم لیزوزیم یا اتیلن دی آمین تتراستات (EDTA) یا مخلوطی از آنها استفاده می شود. لیزوزیم با عمل آنزیمی خود باعث تجزیه پپتید و گلیکان دیوارة سلولی می شود و EDTA که یک عامل شلات کننده است با حذف یون های فلزی مانند Ca2+ وMg2+ که در استحکام دیواره نقش دارند، دیواره را سست می کند. به علاوه EDTA با حذف یون های فلزی که به عنوان گروه پروتستتیک در آنزیم های تجزیه کننده اسید های نوکلئیک عمل می کند، مانع تجزیه این مواد می شود. در سلول های جانوری بعلت فقدان دیواره سلولی، با یک شوک اسمزی ساده می توان غشاء سلول ها را شکست. با اینحال اغلب از موادی مانند سدیم دود سیل سولفات (SDS)، دو دسیل سارکوزین و تریتون- X100 که غشا را در خود حل می کنند استفاده می شود. SDS همچنین باعث پایداری اسیدهای نوکلئیک می شود. مراحل تهیه عصاره سلولی باید در محلول های محافظت کننده اسیدهای نوکلئیک که معمولا حاوی بافرتریس هیدروکلرید (Tris-HCl)، SDS و EDTA است انجام شود تا کمترین آسیب به مادة ژنتیک برسد. برای استخراج مادة ژنتیک سلول های انسانی، معمولاً از سلول های سفید خون که یک تا سه ساعت مانده اند یا خون منجمد، سلول های کشت یافته مانند کشت فیبروبلاست ها، کشت سلول های پرز های جنینی (CVS) یا کشت سلول های مایع آمنیوتیک استفاده می شود.
خالص سازی DNA برای خالص سازی DNA برحسب نوع سلول و کاربرد مورد نظر، روش های مختلفی ابداع شده است. روش های مزبور از اصول یکسانی تبعیت می کنند که شامل رسوب دادن مرحله به مرحله ناخالصی ها و استخراج DNA خالص می باشد. در این روش ها ابتدا با کمک مواد واسرشت کننده پروتئین ها نظیر فنل، این مواد از عصاره سلولی حذف می شوند. سپس DNA در فاز قطبی (آبی) بصورت محلول استخراج می شود. اگر مقدار پروتئین ها زیاد باشد می توان قبل از مرحله فوق پروتئین ها را با آنزیم های تجزیه کننده مانند پروتئیناز k تجزیه و حذف نمود . پس از جدا کردن فاز آبی، می توان با اضافه کردن الکل هائی نظیر اناتول یا ایزوپروپانول در حضور کاتیون Na+ یا آمونیوم، اسیدهای نوکلئیک را رسوب داد. در سلول های گیاهی و سلول های بافت کبد که مقدار هیدرات های کربن زیاد است برای خالص سازی اسیدهای نوکلئیک از CTAB و محلول نمک استفاده می شود. این محلول فقط باعث رسوب اسیدهای نوکلئیک می شود و پلی ساکاریدها بصورت محلول باقی می مانند. رسوبی که به روش های فوق بدست می آید حاول مخلوطی از RNA و DNA است. برای خالص سازی DNA می توان با اضافه کردن ریبونوکلئاز، RNA را هیدرولیز کرده و DNA خالص بدست آورد. امروزه شرکت های مختلف تهیه کننده مواد بیولوژی مولکولی اقدام به تهیه کیت هایی برای استخراج اسید های نوکلئیک از منابع مختلف سلولی نموده اند که در صورت عدم وجود محدودیت مالی در آزمایشگاه می توان با استفاده از کیت های مزبور در مدت زمان کم و با بازده نسبتا بالائی اقدام به تهیه اسید های نوکلئیک با درجه خلوص بالا نمود. به علاوه سیستم های روبوتیک مختلفی اختراع شده اند که روزانه قادر به استخراج هزاران نمونه از اسید های نوکلئیک از نمونه های مختلف میکروبی، گیاهی و حیوانی می باشند.
روش انجام آزمایش:
۵/۲ میلی لیتر NaOH ۱% را در آب مقطر حل می کنیم سپس ۵/۱ گرم مخمر را به آرامی به محلول اضافه می کنیم و آنها را با هم مخلوط می کنیم و به مدت ۱۰ دقیقه در بن ماری قرار می دهیم.مخلوط را پس از سرد کردن با کاغذ صافی صاف می کنیم و با اسید استیک نرمال PH آن را اسیدی می کنیم.۵ میلی لیتر مخلوط الکل-اسید کلریدریک به آن اضافه می کنیم وخوب هم میزنیم.محلول رویی را دور می ریزیم و رسوب را حدود ۲ الی ۳ بار با الکل ۹۶ درجه می شوییم رسوب باقی مانده DNA است
نظرات شما عزیزان:
